מהי סינתזת פפטיד

 

סינתזת פפטידים היא תחום פעיל בכימיה של חלבונים ופפטידים, הכוללת בדרך כלל הוספה רציפה של חומצות אמינו בסדר מוגדר ליצירת שרשרת הפפטידים בשיטות כימיות. שיטות הסינתזה העיקריות הן סינתזה של שלב נוזלי ושל שלב מוצק. בהשוואה ל-LPPS, ל-SPPS יש את היתרונות של להיות מהיר יותר, פשוט יותר, עם פחות תגובות לוואי, ותשואות גבוהות יותר.

 

שיטת SPPS סטנדרטית, כולל אסטרטגיות Boc (בנזיל) ו-Fmoc (tBu).

 

 

אסטרטגיית בוק (בנזיל).

בגישת סינתזה זו, שרף פוליסטירן עם כלורומתיל, הידרוקסי-מתיל ו-p-methoxybenzyl (PMA) משמשים כתומכים מוצקים. קבוצת האמינו מוגנת באמצעות t-butoxycarbonyl (Boc), בעוד שקבוצות שרשרת צד של חומצות אמינו מוגנות עם נגזרות בנזיל. קבוצת Boc מוסרת באמצעות TFA מסודר או TFA ב-CH2Cl2, ובסוף הסינתזה, מסירים קבוצות הגנה על שרשרת צד וקשרי פפטיד-שרף עם חומצה חזקה כמו חומצה הידרופלואורית (HF) או TFMSA.

 

אסטרטגיית Fmoc (tBu).

בגישת סינתזה זו, Wang-resin, 2-Chlorotrityl Chloride Resin, Rink amide-AM Resin, Rink amide-MBHA שרף משמשים כתומכים מוצקים. קבוצת ה-amino מוגנת באמצעות 9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc ), בעוד שקבוצות שרשרת צד של חומצות אמינו מוגנות באמצעות קבוצות הגנה בלתי ניתנות לחומצה. קבוצת Fmoc מוסרת באמצעות 20% piperidine ב-DMF, ובסוף הסינתזה מסירים קבוצות הגנה על שרשרת צד וקשרי פפטיד-שרף עם 1%-95% TFA. Fmoc SPPS היא כיום השיטה המועדפת לסינתזת פפטידים.

 

עקרונות בסיסיים של סינתזת פפטידים מוצק Fmoc

 

בחר שרף

השרפים המיושמים ביותר ב-Fmoc SPPS כולל שרף 4-Alkoxybenzyl alcohol (Wang), 2-Chlorotrityl chloride resin, Rink Amide Resin, Rink Amide-MBHA resins. שרפי אמידים משמשים לסינתזה של פפטידים עם אמידציה מסוף C הנדרשת. שרף Wang ושרף 2-Cl Trt משמשים בדרך כלל לסינתזה של פפטיד עם COOH ללא COOH מסוף הנדרש. אך כאשר בקצה ה-C של הפפטיד יש Pro ו-Gly כחומצת האמינו הראשונה, אין להשתמש בשרף Wang עקב הסיכון להיווצרות DKP (diketopiperazine), 2-שרף Chlorotrityl Chloride מומלץ לשימוש.

 

 

הצמדת חומצות אמינו מוגנות לשרף

חומצת האמינו הראשונה של Fmoc מחוברת לשרף תמיכה בלתי מסיס באמצעות מקשר רגיש לחומצה.

 

הסרת ההגנה של קבוצת ההגנה -אמינו

קבוצת ההגנה הזמנית של Fmoc בקצה ה-N של השרף הפפטידיל מוסרת על ידי טיפול בתמיסה של 20% פיפרידין ב-DMF. תגובה זו מסתיימת בדרך כלל תוך 10 עד 20 דקות.

 

שלבי כביסה

לאחר כל תגובה כימית, מבוצעים שלבי שטיפה להסרת עודפי ריאגנטים, תוצרי לוואי ומולקולות שלא הגיבו מהשרף. זה עוזר לשמור על טוהר שרשרת הפפטידים הגדלה.

 

הפעלה וצימוד של חומצת האמינו המוגנת

חומצת האמינו המוגנת הקשורה לשרף מופעלת כדי לשפר את התגובתיות שלה לצימוד עם חומצת האמינו הבאה ברצף. סוכני הפעלה נפוצים כוללים HOAt, HOBt, PyBOP, PyAOP, HBTU ו-HATU. צימוד כרוך ביצירת קשר פפטיד בין חומצת האמינו הפעילה לקבוצת האמינו של שרשרת הפפטידים הגדלה. מבחן קייזר משמש בדרך כלל לניטור שלמות תגובות הצימוד.

 

שלבי כביסה

בדומה לשלבי שטיפה קודמים, זה מבטיח הסרה של ריאגנטים ותוצרי לוואי עודפים לאחר תגובת הצימוד.

 

מחשוף משרף והסרה של קבוצות הגנה על שרשרת צד

ברגע שרצף הפפטידים הרצוי מסונתז על השרף, הוא מבוקע מהתמך המוצק באמצעות קוקטייל מחשוף כגון חומצה טריפלואורית (TFA) המכילה חומרי נבלות כמו תיואניסול ומים. במקביל, מוסרות קבוצות הגנה על שרשרת צד על שאריות חומצות אמינו, מה שחושף את הפפטיד שהוסר במלואו מוכן לטיהור וניתוח.